二手液相色谱操作指南：从新手到老手的进阶之路

一、水相溶质溶解技巧

在水相中溶解无机盐和表面活性剂等固体溶质时，推荐采用加热法而非振摇或超声法。这是因为振摇或超声可能导致溶质处于临界胶团浓度状态，一旦遇到特定条件（如有机溶剂的加入或温度骤降），溶质容易析出结晶。这些结晶一旦形成，会对二手液相色谱仪和色谱柱造成损害，例如泵头处可能出现盐和白粉的析出。

二、流动相的精准配制与应用

1. 恒度洗脱的规范操作

恒度洗脱时，应将水相与有机相混合后，通过混合型过滤膜进行抽滤，并用一个管路（如A管）泵入仪器。这种做法是为了避免使用两个管路分别泵入纯水相和纯有机相，因为这样做可能导致水相中的盐和表面活性剂析出。剩余的流动相在密封后存放在阴凉处，下次实验时与新配制的流动相混合抽滤即可使用。

1. 梯度洗脱的科学策略

梯度洗脱时，科学的流动相配制方式是A相为高比例水相-低比例有机相，B相为低比例水相-高比例有机相（符合英国药典的常规做法）。次优选择是A相为高比例水相-低比例有机相，B相为纯有机相。最不推荐的是A相为纯水相，B相为纯有机相，因为这种方式可能导致基线漂移严重，影响杂质检测的稳定性。梯度洗脱结束后，建议通过5分钟的时间回到初始状态，并再平衡5分钟后开始下一针测定，以确保系统的稳定性。

三、色谱柱的正确安装步骤

为了确保色谱柱的准确安装，应遵循以下标准步骤：首先，将A管路放入流动相瓶中，然后拧松泵头，将流速从0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒。接着，拧紧泵头，观察流动相是否呈抛物线状从安装色谱柱的一端喷出，持续5秒。然后，将流速逐步降至1.0ml/min，安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端。最后，手握两端螺丝帽，拧紧。这一步骤遵循了逐级排放气泡和仪器内存留洗液的原则，确保安装后气泡极难混入。

四、色谱柱清洗策略

1. C8柱和C18柱的清洗

对于常用的C8柱和C18柱，如果流动相仅为乙腈-水或甲醇-水，则继续冲洗30分钟，流速为1.0ml/min，柱温保持试验时温度即可。如果水相中含有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质，则先采用纯水（或含有2%甲醇）冲洗A管路，时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃。随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。清洗结束后，将色谱柱放置阴凉处。

1. 其他类型色谱柱的清洗

对于其他类型的色谱柱，应查询并遵循科学合理的使用与清洗保存方法，切勿盲目操作，以免损害色谱柱性能。

五、实验操作流程优化

为了确保实验的顺利进行，应优化实验操作流程。首先，在0~2小时内配制流动相、对照品和供试品溶液等。然后，在2~3小时内采用A管路注入流动相并平衡1小时。接着，在3~5小时内测定空白溶剂，确保基线不漂移后方可开始测定。在5~8小时内配制完所有样品，并设定好自动进样程序。最后，在9~24小时内让仪器自动进样，充分利用下班后的时间。第二天上班后，检查并计算试验结果，如有需要则重新测定不良记录。最后，冲洗色谱柱并交给后续实验的同事。

六、液相软件的高效应用

现今主流液相色谱仪的硬件性能已相差无几，关键在于软件的设计是否便捷高效。因此，建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，以提高工作效率。通过合理利用软件功能，可以大幅提升数据处理速度和质量。

七、其他注意事项

1. 如需使用正相系统，应单独采用一台仪器以避免对仪器造成损伤。

2. 正相所使用的流动相无需抽滤，混匀超声后即可使用。

3. 为了确保实验的准确性和稳定性，建议配备柱温箱。如果预算有限，可以考虑购买国产柱温箱。